Кратко — последовательность и набор методов для выяснения молекулярных механизмов химиорезистентности:
1. Подтверждение фенотипа
- Строительство кривых чувствительности к лекарству (дозозависимые тесты; определение IC50/GR50) — MTT/CellTiter-Glo, колониеобразующие тесты; сравнение с чувствительной исходной линией и клонами-рестортами.
2. Классификация возможных механизмов (направления анализа)
- Усиленный вынос препарата (транспортеры), метаболизм препарата, изменение мишени лекарства, повышение репарации ДНК, активация про‑выживающих путей/снижение апоптоза, эпигенетическая регуляция, фенотипическая пластичность (EMT/CSC), изменение метаболизма, аутофагия/протеасома.
3. Оценка выноса и накопления препарата
- Тесты на активность ABC‑транспортеров: накопление rhodamine 123 / calcein‑AM с и без ингибиторов (вертепорфин/кетоконазол и т.п.); экспрессия ABCB1/ABCC1/ABCG2 — qPCR, Western, поточная цитометрия.
4. Геномный анализ
- Целевое секвенирование/панель, WES для поиска соматических мутаций, CNV-анализ; поиск мутаций в мишенях лекарства и путях резистентности.
5. Транскриптомика и одно‑клеточные методы
- RNA‑seq (bulk) для дифф. экспрессии и GSEA; single‑cell RNA‑seq для выявления субпопуляций и переходов клеточных состояний.
6. Протеомика и фосфопротеомика
- LC‑MS/MS для изменения белкового профиля и путей фосфорилирования (активация сигнальных каскадов: PI3K/AKT, MAPK и др.).
7. Эпигенетика и регуляторная хроматиновая структура
- ATAC‑seq для доступности хроматина, ChIP‑seq для ключевых транскрипционных факторов, анализ метилирования (bisulfite‑seq или массивы).
8. Функциональные генетические подходы
- CRISPR KO/CRISPRi/CRISPRa библиотеки или shRNA/siRNA для скрининга генов, дающих резистентность/сенситивность; подтверждение кандидатов одиночными нокаутами/оверэкспрессией.
9. Метаболомика и функциональные метаболические тесты
- GC/LC‑MS метаболомика; Seahorse — оценка дыхания/гликолиза; исследование роли метаболических путей в устойчивости.
10. Оценка репарации ДНК и повреждений
- γH2AX фокус‑тесты, комет‑ассей, assays для NER/HR/BER (reporter‑системы), экспрессия факторов репарации.
11. Апоптоз, аутофагия, клеточный цикл
- Annexin V/PI, caspase‑активность, Western (Bcl‑2 family, LC3, p62), SA‑β‑gal (сенесценция), анализ цикла (PI/EdU).
12. Клеточная пластичность и стволовые свойства
- Маркеры CSC (CD44/CD24, ALDH), сфеерные/транзиентные колонигенные тесты, транскрипционные программы EMT (E‑cadherin, vimentin).
13. Фармакологические и комбинационные экраны
- Скрининг малых молекул/ингибиторов путей для реверсии резистентности; синергия комбинаций; восстановление чувствительности при ингибировании кандидатов.
14. Валидация in vivo
- Ксенографты/PDX с лечением; оценка роста и ответа на препарат при модуляции кандидатов (shRNA/CRISPR, ингибиторы).
15. Экспериментальный дизайн и контроль качества
- Несколько биологических реплик, независимые устойчивые клоны, контроль чувствительной линии, разные дозы и временные точки, подтверждение методами разных уровней (транскрипт/белок/функция).
16. Приоритетные шаги (практическая дорожная карта)
- 1) Подтвердить фенотип (дозозависимые кривые, колонии). 2) Быстрые скрины: qPCR/Western для транспортеров, маркеров апоптоза/репарации. 3) RNA‑seq + proteomics для гипотез. 4) Функциональные CRISPR/siRNA тесты по кандидатам. 5) Валидация фармакологически и in vivo.
Применяйте мульти‑омные и функциональные подходы параллельно — это ускорит выделение ключевых механизмов и мишеней для обратной модуляции резистентности.