Кратко — принципы, главные ограничения при низкой концентрации мишени в «грязных» матрицах и практические способы их минимизации.
1) Принцип амплификации (PCR и модификации)
- Классический PCR: многократное циклическое удвоение целевого фрагмента с помощью полимеразы; при идеальной эффективности после $n$ циклов число копий $N=N_0(1+E{)}^n$ (где $N_0$ — начальное число, $E$ — эффективность, идеал $E=1$).
- qPCR: мониторинг накопления продукта в реальном времени; пороговый цикл $Ct$ связан с $N_0$ через ту же экспоненциальную модель.
- Digital PCR (dPCR): дробление образца на многие реплики/капсулы, детекция позитивных/негативных перегриблений и расчет концентрации по распределению Пуассона: вероятность иметь $k$ копий в перегриблении $P(k)=\frac{{\lambda }^k{e}^{-\lambda }}{k!}$, оценка среднего $\lambda$ по доле положительных перегриблений $p$: $\lambda =-\ln (1-p)$.
- Другие варианты: nested-PCR, multiplex, LAMP и т.д. — изменяют чувствительность/специфичность или удобство.
2) Ограничения и причины ошибок при низкой концентрации мишени в сложных образцах
- Статистическая ("пулевизация") неопределённость: при малом среднем числе копий в алиquote $\lambda$ вариабельность велика; вероятность не иметь ни одной копии $P(0)=e^{-\lambda }$. Для уверенного присутствия (напр., 95% шанс) нужно $\lambda \ge -\ln (0.05)\approx 3$.
- Потери на извлечение и деградация: эффективность экстракции $<100\%$ уменьшает $N_0$; фрагментация ДНК/РНК усложняет амплификацию длинных ампликонов.
- Ингибиторы матрицы (гем, гуминовые кислоты, соли, детергенты) снижают эффективность $E$ или полностью подавляют реакцию.
- Неспецифичность и артефакты при низких шаблонных концентрациях: праймер-димеры, неспецифичные привязки и возрастание фона (особенно при большом числе циклов).
- Контаминация: даже следовые загрязнения амплифицируются и дают ложноположительные; риск растёт при попытках повысить чувствительность.
- Пределы обнаружения qPCR: LOD зависит от эффективности, разброса реплик и контроля; при низких копиях Ct варьирует сильно.
- Мультиплекс и конкуренция: в сложных образцах избыток фона (неспецифичная ДНК) снижает эффективность и чувствительность целевого ампликона.
- Полимеразные ошибки: при единичных копиях случайная мутация в начальном цикле приводит к ошибочной последовательности (особенно при ПЦР-клонировании/секвенировании).
3) Математические соображения точности/LOD
- Экспоненциальность и эффект эффективности: при реальной $E<1$ чувствительность снижается экспоненциально.
- Для dPCR предел обнаружения определяется числом перегриблений $N_p$ и числом разделений; минимально детектируемая концентрация связана с тем, чтобы получить хотя бы несколько положительных перегриблений по Пуассону.
4) Практические подходы для улучшения анализа низкой мишени в сложных образцах
- Максимизировать входной объём/концентрировать извлечённый нуклеин: центрифугирование, элюция в малый объём.
- Улучшить извлечение и очистку: методики удаления ингибиторов, колонки/магнитные шарики, дополнительные шаги очищения.
- Короткие ампликоны ($<100-150$ п.н.) при деградированной ДНК/RNA.
- Использовать ингибиторостойкие поли‑/RT‑полимеразы, добавлять BSA или специальные буферы.
- Реплики и статистика: параллельные реакции уменьшают влияние пуассоновской вариабельности.
- dPCR для абсолютного счета и лучшей чувствительности при низких копиях; применять достаточное число перегриблений.
- Nested-PCR или предамплификация с осторожностью (рост риска контаминации); лучше комбинировать с физической изоляцией и UDG-системой для предотвращения carry‑over.
- Контроли: отрицательные контролы, инги­биторный контроль (внутренний контроль процесса) и стандартные кривые для qPCR.
- Ограничение числа циклов, оптимизация праймеров (специфичность, Тm, отсутствие вторичных структур) и проверка на праймер‑димеры.
- Альтернативы: цель‑улучшение (гибридный захват/ампликонная панель) перед ПЦР; использование метагеномных методов с глубоким секвенированием при необходимости.
Вывод: основные ограничения при низкой концентрации — статистическая дискретность (пуассоновская), потери при извлечении, ингибиторы, неспецифичность и контаминация. Выбор подхода (оптимизация извлечения, dPCR, вложенная амплификация, реплики, очистка ингибиторов) зависит от требований к чувствительности и допустимого риска ложноположительных результатов.