Структурные особенности, определяющие специфичность и скорость гидролиза пептидных связей
- Активный центр и каталитическая химия:
- Каталитические остатки (серин/цис‑теин/аспартат/металл) и их пространственная организация (напр., каталитическая триада Ser–His–Asp у сериновых протеаз) определяют механизм: нуклеофильная атака на карбонильный C → образование тетраэдрического переходного состояния → распад до ацил‑фермента → деациляция.
- Окисание/стабилизация тетраэдрического интермедиата (oxyanion hole) сильно ускоряет реакцию (уменьшает ΔG‡).
- Субстрат‑специфичность (портовые сайты S1, S2, S1′ … и позиции P1, P2, P1′ …):
- Форма и физико‑химические свойства карманов связывания (S1 и др.) определяют какие боковые цепи аминокислот в позиции P1/P1′ благоприятны (гидрофобность, заряд, размер).
- Длинные субстраты могут иметь дополнительные сайты (exosites), повышающие сродство/специфичность за счёт дополнительных контактов.
- Последовательность вокруг разрываемой связи (Pn…P1–P1′…P n′) влияет на ориентацию пептидной связи, мобильность и pKa уходящей группы → влияет на скорость.
- Динамика и доступность:
- Конформационные изменения (induced fit) и гибкость петлей вокруг активного центра регулируют скорость связывания и катализа.
- Доступность места расщепления (структурная упаковка белка) может ограничивать кинетику (нужны денатурация/локальная динамика).
Как это отражается в кинетике (Michaelis–Menten):
- Основные выражения:
- скорость: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M+[S]}$,
- $V_{\max }=k_{cat}[E{]}_T$,
- $K_M\approx \frac{k_{-1}+k_{cat}}{k_1}$,
- каталитическая эффективность: $\frac{k_{cat}}{K_M}$.
- Связь структуры → кинетика:
- Сильное связывание субстрата (высокое $k_1$, малый $k_{-1}$) понижает $K_M$.
- Лучшая стабилизация переходного состояния увеличивает $k_{cat}$.
- Если ограничивающим шагом является образование/распад ацил‑энзима (например, медленная деациляция), то $k_{cat}$ определяется соответствующим химическим шагом.
Влияние конкурентных и неконкурентных ингибиторов
- Вводим параметры: $\alpha =1+\frac{[I]}{K_I}$, ${\alpha }^{\prime }=1+\frac{[I]}{K_I^{\prime }}$. Общая формула при смешанном ингибировании:
- $v=\frac{V_{\max }[S]}{\alpha K_M+{\alpha }^{\prime }[S]}$.
- Конкурентное ингибирование (ингибитор связывается с активным центром, имитирует субстрат или переходное состояние):
- для чистого конкурентного: $\alpha >1$, ${\alpha }^{\prime }=1$.
- Зависимость скорости: $v=\frac{V_{\max }[S]}{\alpha K_M+[S]}$.
- Эффекты: $V_{\max }$ не меняется, кажущееся $K_M^{app}=\alpha K_M$ увеличивается (нужно больше [S] для той же скорости). На графике Lineweaver–Burk пересечения по оси $1/V$ одинаково.
- Неконкурентное (чистое) ингибирование (ингибитор связывается с аллостерическим сайтом одинаково на свободном ферменте и комплексе фермент–субстрат):
- для чистого неконкурентного: $\alpha ={\alpha }^{\prime }>1$.
- Формула сводится к: $v=\frac{(V_{\max }/\alpha )[S]}{K_M+[S]}$.
- Эффекты: $K_M$ не меняется, $V_{\max }^{app}=V_{\max }/\alpha$ уменьшается (уменьшение числа активных молекул или их эффективности).
- Смешанное ингибирование (общий случай):
- $K_M^{app}=\frac{\alpha }{{\alpha }^{\prime }}{K}_M$, $V_{\max }^{app}=\frac{V_{\max }}{{\alpha }^{\prime }}$.
- Оба параметра могут изменяться в зависимости от соотношения связываний.
- Ирреверсивные (ковалентные) ингибиторы:
- Уменьшают эффективную концентрацию активного фермента $[E{]}_T$ → прямое снижение $V_{\max }$ (и, следовательно, скорости при всех [S]). Часто ведут к «существенной» потере активности.
Практические следствия для протеаз
- Ингибиторы‑антибиотики/лекарства часто — аналоги переходного состояния (очень сильные конкурентные ингибиторы) или ковалентные «ловушки» для каталитического нуклеофила (например, флуорофосфонаты для сериновых протеаз).
- Мутанты в карманах S1/S2 меняют $K_M$ и/или $k_{cat}$ в зависимости от влияния на связывание или геометрию каталитического акта.
- Если лимитирующий шаг — деациляция, модификация воды/кислотно‑основных остатков сильнее влияет на $k_{cat}$ чем на $K_M$.
Кратко: специфичность задаётся формой и химией карманов связывания и каталитической машиной (триада, metal etc.), скорость — тем, насколько хорошо фермент ориентирует субстрат и стабилизирует переходное состояние (влияет на $k_{cat}$ и $K_M$). Конкурентные ингибиторы повышают кажущийся $K_M$ без изменения $V_{\max }$; неконкурентные снижают $V_{\max }$, не меняя чисто $K_M$ (в чистом случае). Формулы: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M+[S]}$, при конкуренции $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M(1+\frac{[I]}{K_I})+[S]}$, при чистой неконкуренции $v=\frac{(V_{\max }/(1+\frac{[I]}{K_I}))[S]}{K_M+[S]}$.