Вкратце — возможные механизмы и конкретные эксперименты для проверки.
Возможные механизмы (кратко, с пояснениями)
- ДНК‑повреждения / репликационный стресс: повреждение ДНК активирует ATM/ATR → фосфорилируется и стабилизируется p53, что вызывает остановку цикла. (маркер: γH2AX, 53BP1).
- схема: $\text{ДНК повреждение}\to \text{ATM/ATR}\to p53^{\text{P}}\uparrow \to \text{p21}\uparrow \to \text{остановка в}{G}_1/S$ - Окислительный стресс (ROS): повышенные ROS вызывают ДНК‑порчи и активацию p53.
- схема: $\text{ROS}\uparrow \to \text{ДНК/мито. стресс}\to p53\uparrow$ - Онкогенная активация / чрезмерный митогенный сигнал и репликационный стресс (онкоген‑индуцированный): активация онкогенов вызывает репликационный стресс → p53‑реакция.
- Нуклеолярный / рибосомный стресс: выброс рибосомных белков (RPL5/RPL11) ингибирует MDM2 → стабилизация p53.
- схема: $\text{рибосомный стресс}\to RPL5/RPL11⊣MDM2\to p53\uparrow$ - Снижение деградации p53 (нарушение MDM2‑функции или протеасомная дисфункция): p53 накапливается без повышения транскрипции.
- схема: $p53\stackrel{\text{MDM2}}{}p53^{\text{ub}}\to \text{протеасомный распад}$. при $\text{MDM2 дефект}$ — $p53\uparrow$ - Теломерная дисфункция / старение клеток → p53‑зависимый ответ и/или сенесценция (SA‑β‑gal, p16).
- Гипоксия / метаболический стресс — может стабилизировать p53.
Экспериментальные подходы (конкретно, что сделать и что покажет)
1) Подтвердить фенотип
- Кривые роста / пролиферации: подсчет клеток, MTT/XTT, кумулятивный ПД (популяционные удвоения).
- Анализ цикла по проточному цитометру: PI или DAPI + EdU/BrdU пульс для разделения $G_0/G_1$, $S$, $G_2/M$.
- p53: Western blot (total p53) и IF; ответные гены: p21 (Cdkn1a) — WB/qPCR, Mdm2 mRNA.
2) Проверка ДНК‑повреждений / активации сигнальных киназ
- γH2AX и 53BP1 фоки (IF) — укажут на двойные разрывы.
- Комет‑тест (alkaline) для одиночных/двойных разрывов.
- Фосфо‑ATM, фосфо‑ATR, фосфо‑CHK1/CHK2 по WB (например, p‑ATM, p‑CHK2) — покажут активацию.
- Репликационный стресс: RPA и фосфо‑RPA фоки, BrdU/EdU пульс‑чейз.
3) ROS и митохондриальный стресс
- DCFDA (или H2DCFDA) — уровень ROS; mitoSOX — митохондриальные ROS.
- Проба восстановления фенотипа антиоксидантом (NAC): если ROS ответственны, NAC уменьшит p53 и восстановит пролиферацию.
4) Проверить деградацию p53 / MDM2‑axis
- Измерить MDM2 белок/mRNA (WB/qPCR).
- Иммуноосадка p53 с последующим WB на ubiquitin (IP p53 → WB anti‑Ub) — уменьшенная убиквитинация укажет на снижение деградации.
- Протеасомная активность и влияние ингибиторов: MG132 (контроль) — накопление p53; но если уже накоплен, MG132 не даст различий. Тест активности протеасомы in vitro.
5) Нуклеолярный / рибосомный стресс
- Нуклеолярная морфология (NPM1 релокация), co‑IP RPL5/RPL11 — взаимодействие с MDM2.
- rRNA биосинтез (метод EU‑инкорпорации).
6) Теломерный стресс / сенесценция
- TIF (telomere dysfunction‑induced foci): ко‑локализация γH2AX с теломерной FISH.
- SA‑β‑gal окраска, p16 уровни, SASP‑цитокины (ELISA).
7) Функциональные тесты для доказательства причинности
- p53 loss‑of‑function: siRNA/shRNA или CRISPR‑KO Trp53 — если спад p53 восстанавливает цикл, p53 медиирует фенотип.
- Ингибиторы ATM/ATR/CHK1/CHK2 (например, $\text{KU‑55933}$ для ATM, $\text{VE‑821}$ для ATR) — уменьшение p53‑фосфорилирования и частичное восстановление пролиферации при ДНК‑уроне.
- Антиоксиданты (NAC) для ROS‑гипотезы.
- Экспрессия MDM2 (экзогенно) или вмешательство в RPL5/RPL11 (siRNA) для теста рибосомного стресса.
Контрольные измерения и рекомендации по порядку:
1) Сначала подтвердить фенотип: рост + флоуцитометрия + p53/p21 (WB/qPCR).
2) Параллельно измерить γH2AX и ROS (быстрые тесты).
3) В зависимости от результатов: тесты на MDM2/убиквитинацию или рибосомный стресс.
4) Функционально: p53‑нокаут/ингибитор ATM/антиоксидант — чтобы показать причинно‑следственную связь.
Ключевые маркеры для измерения (рекомендуемые): $p53$ total, $p53^{\text{P}}$ (phospho, напр. $Ser18$ у мыши), p21 (Cdkn1a), γH2AX, 53BP1, phospho‑ATM/ATR, MDM2, SA‑β‑gal.
Если нужно — могу перечислить конкретные антитела, протоколы или порядок проб и контролей.